引言

果蠅是遺傳學(xué)科研和教學(xué)中被普遍使用的生物，因?yàn)樗哂腥旧w少、已定位基因數(shù)多，突變性狀多的優(yōu)點(diǎn)，因此，它是研究基因分離、連鎖交換、基因表達(dá)與調(diào)節(jié)的理想材料。提取果蠅DNA并對其特定的基因片段擴(kuò)增是多個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中必要步驟，被廣泛應(yīng)用于各種基礎(chǔ)性或開放性的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程。

提取DNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)PCR擴(kuò)增、限制性酶切以及基因測序的實(shí)驗(yàn)效果。采用常規(guī)昆蟲DNA的提取方法去提取果蠅的DNA不僅耗時長、成本高，而且提取的效果不穩(wěn)定，不適合本科的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。南開大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程組將常用的動物組織DNA提取方法改造后用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，建立了一種高效地提取果蠅DNA的新方法，取得了良好的教學(xué)效果。

實(shí)驗(yàn)過程

材料：實(shí)驗(yàn)中采用的果蠅攜帶有YAP基因

提取方法：

（1）常規(guī)方法一：將兩支果蠅麻醉后置于1.5ml EP管中；加入50uL含proteinase K（質(zhì)量濃度20mg/mL）的Squishing Buffer（SB）緩沖液后用研磨棒將果蠅充分研磨，如沾壁可稍離心；置37℃金屬浴孵育30min，轉(zhuǎn)入95℃金屬浴孵育2min；10000r/min離心3min，取上清液作為DNA模板。

（2）常規(guī)方法二：用剪刀將100uL移液器槍頭的尖部剪去少許后，用移液器吸取50uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的Chelex-100溶液（預(yù)先搖勻）到EP管中，另加入2uL的proteinase K（質(zhì)量濃度20mg/mL）；取兩只麻醉后的果蠅于EP管中，用研磨棒充分研磨，渦旋振蕩30s，于1000r/min離心1min混勻；將EP管置于56℃恒溫水浴鍋中水浴6h，再轉(zhuǎn)入95℃水浴3min，14000r/min離心3min，取上清液作為DNA模板。

（3）高效法：去兩只麻醉后的果蠅于1.5mL的EP管中，加入50uL NaOH堿裂解液（濃度100mmol/L，pH12），用研磨棒將果蠅充分研磨60s，使果蠅蟲體全部碾碎；將EP管放入干式恒溫中100℃孵育100min；之后加入50uL This-HCL（濃度40mmol/L）與原液充分混勻，經(jīng)10000r/min離心2min，取上清液作為DNA模板。

DNA質(zhì)量濃度及純度檢驗(yàn)：三種提取方法各設(shè)二次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到9份樣品，分別取1uL DNA使用超微量分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量濃度、A260/A280和A260/A230，比較三種方法提取的DNA質(zhì)量濃度以及雜質(zhì)情況。數(shù)據(jù)采用平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行單因素方差分析，α=0.05。

PCR擴(kuò)增：對提取的DNA的YAP序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列上游為TGAAACAGCAAGAACTGCTTC；下游為：CACCACTGCTCCCATTCA。PCR反應(yīng)體系20uL，其中，含DNA模板0.4uL，上下游引物各0.4uL（10umol/L），ddH2O 8.8uL，Taq Master Mix 10uL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變形3min；95℃變形15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃再延伸2min，最后保持10℃。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測：取擴(kuò)增后的9分PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，評價三種方法的基因組DNA的PCR擴(kuò)增效率。樣品量8uL，DNA Marker 3uL，核酸染料為GelRed 3uL，電壓100V，電泳時間20min。通過凝膠成像儀成像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、DNA質(zhì)量濃度及純度檢測

統(tǒng)計(jì)DNA質(zhì)量濃度、、A260/A280、A260/A230、提取時長以及成本數(shù)據(jù)（結(jié)果如下表）。高效法和常規(guī)方法一對比的話，提取量十分接近，但濃度更高，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的方差小，提取效果也更好；高效法和常規(guī)方法二對比的話，常規(guī)方法二的DNA質(zhì)量濃度低并且數(shù)據(jù)的方差大，提取效果很不穩(wěn)定，和高效法相比差異明顯。

表1 三種方法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

通過測定A260/A280判斷樣品中的蛋白質(zhì)污染情況，純度較高的DAN的A260/A280在1.6-1.8，低于此范圍說明蛋白質(zhì)含量超標(biāo)，高于此范圍表明樣品中含有RNA。高效法提取樣品的A260/A280約為1.6，表明DNA純度較高，蛋白污染較小，且方差最小，重復(fù)性最好；另外兩種方法提取的樣品A260/A280均低于1.3，蛋白質(zhì)含量超標(biāo)，說明蛋白質(zhì)被污染。

通過測定A260/A230值判斷樣品鹽離子干擾情況情況，若A260/A230小于2.0，表明有小分子和鹽類干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)是，三種方法提取的鹽離子都比較多。

圖1 三種提取方法A260/A280和A260/A230的顯著分析（ns表示無明顯差異，**表示P<0.01）

2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測

對YAP基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，三種提取方法獲得的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶都比較明亮且單一，在1000-1500bp（圖3）.三種提取方法獲得的DNA樣品都滿足實(shí)驗(yàn)需求。

M：DNA Marker；1-3：常規(guī)方法一提取DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；4-6：常規(guī)方法二提取DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；7-9：高效法提取DNA擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

總結(jié)

本文選用的三種方法提取果蠅DNA的質(zhì)量均滿足實(shí)驗(yàn)要求，并且高效法提取的DNA濃度和純度要比常規(guī)方法質(zhì)量更高，方差更小。高效法對比常規(guī)的兩種方法，不因操作步驟少，提取時間更短，并且成本也極低，提取果蠅的DNA效果明顯，非常適合實(shí)驗(yàn)和教學(xué)需求。使用高效法，能為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)奠定更好的基礎(chǔ)，推動課程建設(shè)。